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    免疫熒光實驗為你講述染色的方法

    發(fā)布時間： 2022-07-24　　點擊次數(shù)： 1260次
     
    　　免疫熒光實驗是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
    　　免疫熒光實驗技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
    　　免疫熒光實驗的染色方法：
    　　1、取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
    　　2、加入0.3%的Tritonx-100,37℃,30rain
    　　3、加入4%多聚甲醛試問固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
    　　4、正常阻斷血清1:20封閉試問20-30min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。
    　　5、去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1h或4℃過夜?？贵w以0.01mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定)。
    　　6、0.3%TritonX-100洗5min，0.01mol/IPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01MPBS洗5rain。
    　　7、加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。
    　　8、0.3%TritonX-100洗5rain，0.01mol/LPBS洗5min，0.3%TritonX5min，0.01mol/LPBS洗5min，用濾紙吸干。
    　　9、90%甘油(PBS配制)封片。
    　　10、激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。