肺纖維化動物模型

肺纖維化動物模型動物的選擇

目前，肺纖維化動物模型有采用體型較小鼠類（如小鼠、大鼠、倉鼠等）和兔。其中 C57BL/6 小鼠、BALA/C 小鼠、KM 小鼠和 ICR 小鼠，Wistar 大鼠和SD 大鼠是用于肺纖維化模型是常用的種類，也有選用體型較大的犬、豬、羊和靈長類動物等，模型選用的動物種類因研究目的和造模方法不同而異。

鼠類是較多選用的肺纖維化動物模型，體型小、體重輕、價格便宜，有氣管灌注、霧化吸入、經(jīng)鼻給藥、腹腔注射、靜脈注射等多種給藥方式，是常用的造模動物，但因其體型太小不適用于放射影像學(xué)的研究，需要通過解剖摘取肺部進(jìn)行組織病理學(xué)檢查的方法判斷造模是否成功。

豬、猴等大型動物體型大，心臟及肺部組織結(jié)構(gòu)與人相似，并且可通過影像學(xué)方法在無創(chuàng)條件下動態(tài)觀察動物造模情況，但價格昂貴，操作較復(fù)雜。

造模方法

目前已建立多種誘發(fā)動物肺纖維化模型的方法，包括基因相關(guān)模型與非基因相關(guān)模型。基因相關(guān)模型是指通過基因工程使動物成為肺纖維化模型，而非基因相關(guān)模型是指在相同或相似的遺傳背景下，通過環(huán)境因素、藥物毒物或其他因素誘導(dǎo)得到的肺纖維化模型。

一、肺纖維化動物模型基因相關(guān)方法致肺纖維化模型

轉(zhuǎn)基因方法包括細(xì)胞因子過表達(dá)法、靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷法。

1SD大鼠細(xì)胞因子過表達(dá)法致肺纖維化模型步驟

前期準(zhǔn)備：AdTGF-β1223/225 及腺病毒空載體 -70℃保存，臨用前經(jīng)病毒稀釋液稀釋成 1×109pfu（病毒稀釋液由三種溶液構(gòu)成，其配制方法：A 液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g，加雙蒸水定容至100 mL，高壓消毒；B 液：CaCl2·2H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒；C 液：MgCl2·6H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒。用前取 98 mL A 液、1 mL B 液、1 mL C 液混合備用。

操作步驟：選用 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±15） g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL·kg-1），無菌操作，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露氣管，經(jīng)喉頭下一次性注入 0.4 mL AdTGF-β1223/225 腺病毒液，手術(shù) 6 h 后觀察并記錄動物生理反應(yīng)。

模型驗證：分別與造模后 d 7、d 14、d 21，麻醉后開胸，左心室插管，先灌流溫?zé)幔ㄊ覝兀┥睇}水，剪開右心耳放血，待流出液變澄清后再緩慢灌流 4% 多聚甲醛水溶液（200 mL·30 min-1）。小心摘取整個肺和心，經(jīng)氣管恒壓（2 452 Pa）灌注 4% 多聚甲醛固定液 10 min，使肺泡恢復(fù)擴(kuò)張狀態(tài)。沿縱軸切取肺組織浸入 4% 多聚甲醛固定液中固定 24 h，做常規(guī)石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色和 Mallory 染色，光鏡觀察、攝片。

2靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷法

靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將白喉毒素受體與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞啟動子通過載體融合，白喉毒素不斷刺激轉(zhuǎn)基因小鼠，致肺纖維化。通過敲除特定基因或?qū)胪蛔兓蚴够蛲蛔円材芙?strong>肺纖維化動物模型，與肺纖維化有關(guān)的基因包括：肺表面活性蛋白C、肺表面活性蛋白A2（SFTPA2）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和端粒酶 RNA復(fù)合酶（TERC）。

轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)勢：基因技術(shù)造模方法比較于傳統(tǒng)造模方法，靶點明確，對篩選抗纖維化藥物意義重大。除此之外，通過誘導(dǎo)時間特定啟動子，可模擬肺纖維化晚期出現(xiàn)的臨床癥狀。

轉(zhuǎn)基因方法的劣勢：介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因用的病毒載體本身具有潛在危害性，且人類肺纖維化是多基因多種因子作用的結(jié)果，因此單一的基因模型與多基因相關(guān)的肺纖維化模型存在一定差異。

二、非基因相關(guān)方法致肺纖維化模型

常用的非轉(zhuǎn)基因方法主要為物理化學(xué)方法，包括博萊霉su誘導(dǎo)法、平陽霉su誘導(dǎo)法、百cao枯誘導(dǎo)法、石棉誘導(dǎo)法、輻射誘導(dǎo)法。化學(xué)誘導(dǎo)法及石棉誘導(dǎo)法通常通過皮下、靜脈注射，或者霧化吸入等途徑給藥，輻射誘導(dǎo)法則直接進(jìn)行射線照射。

1博萊霉su致肺纖維化模型

博萊霉su誘導(dǎo)肺纖維化有氣管內(nèi)一次給藥或多次給藥，也有腹腔給藥、鼻內(nèi)給藥、靜脈給藥、霧化吸入多種方式。氣管內(nèi)一次給藥是常用的造模方式。

1.1 大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：選用健康雄性8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，用 10% 水he氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于實驗臺，開口器固定口腔，拉出舌，用壓she板壓舌腹，在額鏡直視下，趁動物吸氣瞬間迅速行氣管插guan（Ф 2 mm，4~5 cm），緩慢注入 5 mg·kg-1BLM 0.2~0.3 mL，立即旋轉(zhuǎn)動物，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標(biāo)本。

特點：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時間短等優(yōu)點，但動物死亡率較高，操作復(fù)雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周圍為顯著的特點。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉su誘導(dǎo)的動物肺纖維化是國內(nèi)外常用、受認(rèn)可的肺纖維化模型。

1.2 倉鼠氣管內(nèi)注射博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：取10 周齡雄性敘利亞倉鼠，用生理鹽水配制 1 U 博萊霉su溶液，單次氣管內(nèi)注射 0.1 mL，注射藥物 3 周后，取肺組織進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，3H-TdR 整合實驗評估成纖維細(xì)胞增殖效果。

特點：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時間短等優(yōu)點，但動物死亡率較高，操作復(fù)雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周圍為顯著的特點。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉su誘導(dǎo)的動物肺纖維化是國內(nèi)外常用、受認(rèn)可的肺纖維化模型。

1.3 大鼠腹腔內(nèi)注射博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：選用健康雄性 8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，每日腹腔注射 15 mg·kg-1 BLM 10 天，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標(biāo)本。

特點：腹腔內(nèi)給藥法具有給藥次數(shù)多、劑量大、制模時間長等缺點，但動物死亡率相對較低，且操作簡便，急性肺損傷程度較輕、膠原代謝紊亂的程度較重，病灶分布均勻，以胸膜下為顯著的特點。

1.4 小鼠鼻腔滴入博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：選用 SPF 級雌性 ICR 小鼠，6~8 周齡，體質(zhì)量16~18 g，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，鼻腔滴注博萊霉su造模。用yi醚麻醉小鼠，后用微量移液器吸取 50 μL 博萊霉su溶液（15 mg·kg-1 進(jìn)行干預(yù)），經(jīng)鼻腔緩慢滴入小鼠氣管內(nèi)，放入鼠籠內(nèi)安置，觀察其造模后一般情況。